Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

F390|Ca0/F390|Ca* - отношение флуоресцентных сигналов в низкой и высокой концентрации Ca2+ при возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры Rmin, Rmax и b определяли экспериментально. Для этого были приготовлены базовый раствор (в ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 - 0.005; раствор с низкой концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с добавкой CaСl2 - 10. Отношение величин флуоресценции определялось в каплях приведенных выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры. В результате для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и b=12.8. Параметр Кd был взял из работы [Grinkiewicz et al, 1985] и равнялся 224 нмоль/л.

3.3 Окраска срезов флуоресцентным красителем

Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы инкубировались в растворе Тироде, содержащим эстерифицированную незаряженную форму красителя Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5 мкмоль/л, растворенную в диметилсульфоксиде с добавлением детергента Плуроник F-127 (0.02%). В такой форме краситель проникает в клетку, затем эндогенными эстеразами эфирные группы отщепляются, зонд становится заряженным и покинуть клетку не может. Окраска производилась 20 минут при температуре 35оС. Концентрация зонда в клетке определялась путем титрования окрашенных клеток раствором красителя, который добавлялся во внеклеточный раствор. Оцененная таким способом концентрация зонда в клетке была в диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.

3.4 Структура экспериментальной установки для двух-волнового измерения концентрации кальция

Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп, ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.

Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт. Поскольку в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор Фура -2 АМ, являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для количественного определения [Ca2+]i необходимо было одновременно индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи вращения колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами 360 и 390 нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены фильтров осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы Luigs und Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом предварительной обработки.

Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа Axioskop, Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции производилось при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через фильтр для возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и при помощи высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75) фокусировался на объекте. Флуоресцентный свет проходил через соответствующий интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Для уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1 мм) была расположена перед ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал собирался с фокальной плоскости диаметром 50 мкм, что позволило значительно улучшить соотношение сигнал/шум.

Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в Гейдельберге, Германия.

Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для двухволнового измерения кальция.

3.5 Растворы и смена растворов

При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде (в ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5, NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10, постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2 + 5% СО2 (pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой CaCl2 на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или кофеина.

Смена растворов производилась протоком, скорость которого можно было варьировать от 10 до 20 мл/мин. Объем экспериментальной камеры составлял 0.5 мл. Все эксперименты были проведены при температуре (32 С).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Аппликация АТФ в большинстве нейронов моторной коры (98 из 102) вызывает быстрое и кратковременное повышение концентрации цитозольного кальция [Ca2+]i . Концентрация [Ca2+]i достигает своего максимума на протяжении 6-8 секунд и затем восстанавливается до базального уровня при продолжающемся присутствии АТФ. Отмывание АТФ приводит к восстановлению [Ca2+]i до уровня покоя. Характерный вид АТФ - индуцированного кальциевого транзиента представлен на рисунке 5.

Амплитуда АТФ - индуцированного кальциевого транзиента варьировалась в пределах от 50 до 450 нМ. Среднее значение выброса [Ca2+]i вызванного приложением АТФ в концентрации 100 мкМ находилось в пределах 200-250 нМ.

Наблюдалась доза - зависимость амплитуды ответа от концентрации АТФ в пределах от 10 до 2000 мкМ. На рисунке 7 представлена апроксимация экспериментальных точек сигма - функцией. Концентрация АТФ, при которой амплитуда ответа составляет половину максимальной, - 220 * 20 мкМ.

Целью наших исследований было определение подтипов пуринорецепторов вовлеченных в генерацию [Ca2+]i транзиента. Известно, что АТФ активирует несколько типов пуринорецепторов, а именно Р2 пуринорецепторы подтипов Р2х и Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), а также Са2+ каналы плазмалеммы (Кришталь, 1983).

С целью обеспечения достоверности полученных данных, принимая во внимание тот факт, что работа проводилась на тонких срезах мозга, мы провели серию экспериментов с подавлением распостранения потенциалов действия с помощью тетродотоксина (TTX). При использовании TTX выяснилось, что амплитуда и форма [Ca2+]i транзиентов не изменяется или изменяется незначительно. Полученные результаты позволяют нам предполагать, что получаемые нами данные отображают процессы происходящие в отдельной наблюдаемой клетке. К сожалению мы не имели возможности проводить все эксперименты c тетродотоксином из-за дороговизны препарата. Для изучения характеристик рассматриваемых пуринорецепторов, принимающих участие в генерации [Ca2+]i транзиента, применялись следующие протоколы экспериментов.

1. Приложение АТФ в растворе не содержащем Ca2+. Удаление кальция из внеклеточного раствора незначительно влияло на кальциевый транзиент, вызванный аппликацией 10 мкМ АТФ, но в тоже время подавляло на 45% * 7% кальциевый транзиент вызванный 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).

1. Для исследования способности внутриклеточного Ca2+ депо к перезаполнению мы последовательно апплицировали АТФ несколько раз с интервалом в 60 секунд в обычном растворе и в растворе не содержащем Ca2+ . Как видно из рисунка 9 вторая аппликация АТФ вызывала Ca2+ транзиент меньшей (на 30%  4%) амплитуды по сравнению с первой (контрольной) аппликацией. Последующие аппликации АТФ разделенные 60 ти секундным интервалом не вызывали заметного уменьшения амплитуды [Ca2+]i транзинета по сравнению со второй аппликацией в стандартном растворе

В бескальциевом растворе - наоборот, вторая аппликация АТФ вызывала значительное уменьшение Ca2+ транзиента на 40%  5% от контроля. Последующие аппликации АТФ в бескальциевом растворе приводили к последовательному уменьшению амплитуды [Ca2+]i транзиента и после двух - трех последовательных аппликаций сигнал исчезал вообще (рисунок 10). Такое уменьшение вероятно обусловлено истощением внутриклеточных депо.

1. Ингибирование захвата Ca2+ эндоплазматическим ретикулом тапсигаргином (спецефическим блокатором Ca2+ насоса эндоплазматического ретикулума) уменьшало [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением АТФ, на 63%  5% для концентрации АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Как видно из рисунка 11 приложение тапсигаргина не влияло на базальный уровень Ca2+ в клетке.

1. Приложение кадмия в концентрации 50 мкМ, верапамила в концентрации 100 мкМ и 50 мкМ никеля обратимо уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзиента вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, и 15% сответственно. Данные представлены на рисунке 12.

1. Приложение различных агонистов пуринорецепторов вызывало различные по амплитуде ответы. Порядок относительной активности лигандов для данного объекта был следующим ATPS  ATФ = AДФ  ,-methylene ATP  AMФ  УТФ аденозин (ADO), данные преставлены на рисунке 13.

1. Сурамин, известный антагонист Р2 типа пуринорецепторов, уменьшал [Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением 100 мкМ АТФ на 76%  7% и также не изменял концентрацию [Ca2+]i в покое. Данные представлены на рисунке 14.

5. ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании средних слоев неокортекса крыс мы обнаружили их способность отвечать на приложение АТФ. Таким образом мы можем сделать вывод о наличии в данном объекте пуринорецепторов. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ. Последовательные приложения АТФ, после второго приложения, не вызывали уменьшения амплитуды [Ca2+]in транзиентов. Из этого можно сделать вывод