Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс

вывод об отсутствии десенситизации данного типа рецепторов.

Исследуя источники повышения цитозольного кальция мы обнаружили, что АТФ активирует как ионотропные так и метаботропные рецепторы. Блокаторы потенциал - управляемых кальциевых каналов такие как кадмий, никель и верапамил уменьшали АТФ - индуцированные кальциевые транзиенты на 35% - 15%, что говорит об опосредованном АТФ активировании потенциал - управляемых каналов.

Для исследования активацию метаботропных рецепторов. Для этого мы прилагали АТФ в бескальциевом растворе, - амплитуда ответа при этом уменьшалась на 45%  7%. Этот результат говорит о том, что внутриклеточные депо принимают участие в генерации [Ca2+]in ответов, причем их вклад близок к половине. При повторных аппликациях АТФ в бескальциевом растворе Ca2+ ответ исчезал полностью после второй аппликации, т.е. внутриклеточные депо полностью истощаются. Исследуя путь высвобождения внутриклеточного кальция мы апплицировали тапсигаргин - спецефический блокатор АТФ - азы эндоплазматического ретикулума. [Ca2+]in транзиенты уменьшались на 63%  5% в присутствии тапсигаргина. Аппликация коффеина, агониста рианодиновых рецепторов, в клетках моторной коры 14 дневных крыс не вызывали повышения уровня [Ca2+]in . Следовательно выброс [Ca2+]in из внутриклеточного депо происходит по IP3 - чувствительному механизму.

В дальнейшем мы исследовали более подробно типы присутствующих пуринорецепторов. Построив ряд активности агонистов для Р1 и Р2 пуринорецепторов по амплитудам ответов, мы сделали заключение базирующееся на отсутствии ответа на аденозин, что в нашем объекте присутствуют только Р2 пуринорецепторы. Проводя дальнейшую субклассификацию Р2 типа рецепторов мы использовали сурамин - блокатор некоторых типов Р2х и Р2у рецепторов. Приложение сурамина уменьшало амплитуду [Ca2+]i транзинета вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 76%  5%, что говорит о наличии этих типов рецепторов в исследуемом объекте.

6. ВЫВОДЫ

1. Приложение АТФ в различных концентрациях вызывает Ca2+ транзиенты в клетках моторной коры крыс.

2. Ответ на АТФ является доза - зависимым с амплитудой половинного ответа в 220 нМ.

3. АТФ активирует как ионотропный так и метаботропные пути повышения внутриклеточного кальция.

4. В генерации АТФ индуцированного повышения [Ca2+]in принимают участие некоторые типы потенциал - управляемых кальциевых каналов.

5. Высвобождение внутриклеточного кальция происходит из IP3 чувствительных депо.

6. В данном объекте присутсвуют только Р2 подтипы пуринорецепторов.

7. Сурамин - антагонист Р2Х2 и Р2Х5 и Р2У рецепторов уменьшает амплитуду [Ca2+]in транзиенты, что говорит присутствии некоторых из вышеперечисленных рецепторов.

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. A.Shmigol, A.Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology (London), 489.3 627-636.

2. A.Shmigol, G. Isenberg, P.Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calcium-induced Ca2+ release from internal stores in rat dorsal root ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7, Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146.

3. A.Shmigol, N.Svichar, P.Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995): “Incremental” caffeine-induced calcium release in mouse sensory neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple № 8. p111. Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting.

4. A.Shmigol, Yu.Usachev, N.Pronchuk, S.Kirischuk, P.Kostyuk & A.Verkhratsky (1994): Properties of the caffeine sensitive intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology /Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16 - 25.

5. A.Verkhratsky, A. Shmigol, S. Kirischuk, N. Pronchuk & P. Kostyuk (1994): Age-dependent changes in calcium currents and calcium homeostasis in mammalian neurons. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 747, p365 - 381.

6. Abbracchio, M. P., Burnstock, G. (1994) Purinoceptors: are there families of P2x and P 2y purinoceptors? Pharmac. Ther. 64: 445-475

7. Anatoly Smigol, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Role of caffeine-sensitive Ca2+ stores in Ca2+ signal termination in adult DRG neurones // NeuroReport v.5, 2073-2076.

8. Anatoly Smigol, Sergey Kirischuk, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripherial and central mammalian neurones // Pflugers Arch v.426, 174-176.

9. Baker P. F., Blaustein M.P., Hodgkin A.L. and Steinhardt R. A. (1969) The influence of calcium on sodium efflux in squid axons. J. Physiol., Lond. 200, 431 458.

10. Bean B.P. (1992) Pharmacology and electrophysiology of ATP activated ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 13, 87 90.

11. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. (1993) Calcium clamp in isolated neurones of the snail Helix pomatia. J. Physiol., Lond. 462, 47 58.

12. Bronner, F. (1990). Intracellular Ca2+ regulation.. New York: Wiley Liss.

13. Burk S. E., Lytton J. , MacLennan D. H. and Shull G. E. (1989). cDNA cloning, functional expressing, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. J. Biol. Chem. 164, 18561 18568.

14. Burnstock, G. (1972) Purinergic nerves. Pharmacol. Rev. 24: 509-581

15. Burnstock, G. (1978) A basis for distinguishing two types of purinergic receptor. in: book

16. Burnstock, G. (1990) Co-transmission. Arch. Int. Pharmacodyn. 304: 7-33

17. Burnstock, G., Kennedy, C.(1985) Is there a basis for distinguishing two types of P2 purinoceptor? Gen.Pharmacol. 16: 433-440

18. Carafoli E. (1992) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev. 71, 129 153.

19. Chen, C.-C., Akopian, A.N. et al, (1995) A P2x purinoceptors expressed by a sybset of sensory neurones. Nature 377: 428 - 431

20. Кришталь О.А., Марченко С.М. (1983). Рецепторы АТФ в сенсорных нейронах млекопитающих. Докл. Акад. Наук УССР.

21. Gianini G., Clementi E., Ceci R., Marziali G., and Sorremtino V. (1992) Expression of a ryanodine receptor Ca2+ that is regulated by TGF b, Science, 257, 91 94.

22. Ginetta Collo et al, (1996) Cloning of P2X5 andP2X6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. The J. of Neurosci. 16(8): 2495-2507

23. Gordon, J. L. (1986) Extracellular ATP: effects, sources and fate. Biochem.J. 233: 309-319

24. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol. Chem., 260, 3440-3450, 1985.

25. Heizmann C.W. and Hunziker W. (1991) Intracellular calcium binding proteins: more sights than insights. Trends Biochem. Sci. 16, 98 103.

26. Heschler J. and Schultz G. (1993) G proteins involved in the calcium channel signalling system. Curr. Opin. Neurobiol. 3, 360 367.

27. Hiderman, R. H., Martin, M., Zimmerman, J. K., Pivorun, E. B. (1991) Identification of a unique membrane receptor for adenosin 5,5- P1,P4-tetraphosphate. J. Biol. Chem. 266: 6915-6918

28. Hoyle, C. H. V. (1990) Pharmacological activity of adenine dinucleotides in the periphery: possible receptor classes and transmitter function. Gen. Pharmacol. 21: 827-831

29. Hymel L., Inui M., Fleischer S. and Schindler H. (1988). Purified ryanodine receptor of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum forms Ca2+ activated oligomeric Ca2+ channels in planar bilayers. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 441 445.

30. Kirischuk S.I., Voitenko N.V., Kettenmann H.O. and Verkhratsky A.N. (1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Bergman glial cells // Neurophysiology v.26, 417-419.

31. Kirischuk, V.Matiash, A.Kulik, N.Voitenko, P.Kostyuk, A.Verkhratsky (1996) Activation of P2-purino, 1-adreno and H1-histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Pupkinje neurons // Neuroscience v.73, 643-647

32. Kostyuk and A. Verhratsky (1994) Calcium stores in neurones and glia //Neuroscience v. 63, N.2, 381-404.

33. Kostyuk P. G. (1992). Calcium ions in nerve cell function. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press.

34. Kuno M., Maeda N. and Mikoshiba K. (1994) IP3 activated Ca2+ permeable channels in the incide out patches of cultured cerebellar Purkinje cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 199, 1128 1135.

35. Lуckhoff A. and Clapham D.E. (1992) Inositol 1,3,4,5 tetrakisphosphate activates an endothelial Ca2+ permeable channel. Nature 355, 356 358.

36. Londos, C., Cooper, D. M. F., Wolff, J. (1980) Subclasses of external adenosine receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2551-2554

37. Lytton J., Westlin M. and Hanley M. R. (1991). Thapsigargin inhibits the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca ATPase family of calcium pums. Biol. Chem. 266, 17067 17071.

38. Mackgrill J. J. and Lai F. A. (1994). Solubilization of the type 3 ryanodine receptor from rabbit brain. Biophys. J. 66, A147

39. McPherson P. S., Kim Y. K., Valdivia H., Knudson C. M., Takekura H., Franzini Armstrong C., Coronado R. and Campbell K. P. (1991). The brain ryanodine receptor: A caffeine sensitive calcium release channel. Neuron 7, 17 25.

40. N.Voitenko, S.Kirischuk, A.Kulik, A.Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones of the mouse cerebellar slices // Pflugers Archiv European Journal of Physiology, v.430, Supplement 4, R124.

41. Nicholls