Белки: история исследования, химсостав, свойства, биологические функции

CO – L-Ala – D-Glu – NH – CHCH2CH2CH2CHCO – D-Ala(CO) –

| |

COO – NH

|

Каждая С-концевая группа этого пептида, принадлежащая остатку D-аланина, обра-зует амидную связь с аминогруппой остатка диаминонимиелиновой кислоты, принадле-жащей соседней полисахаридной цепи.

Кроме вышеприведенной функции гликопротеиды участвуют в транспорте различных веществ, в процессах свертывания крови, иммунитета, являются составными частями слизи и секретов желудочно-кишечного тракта. У арктических рыб гликопротеиды играют роль антифризов – веществ, препятствующих образованию кристаллов льда внутри их орга-низма.

Фосфопротеиды. Имеют в качестве небелкового компонента фосфорную к-ту. Представителями данных белков являются казеиноген молока, вителлин (белок желтков яиц), ихтулин (белок икры рыб). Такая локализация фосфопротеидов свидетельствует о важном их значении для развивающегося организма. У взрослых форм эти белки присут-ствуют в костной и нервной тканях.

Липопротеиды. Сложные белки, простетическая группа которых образована липи-дами. По строению это небольшого размера (150-200 нм) сферические частицы, наружная оболочка которых образована белками (что позволяет им передвигаться по крови), а внутренняя часть – липидами и их производными. Основная функция липопротеидов – транспорт по крови липидов. В зависимости от количества белка и липидов, липопротеиды подразделяются на хиломикроны, липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) и высокой плотности (ЛПВП), которые иногда обозначаются как - и -липопротеиды.

Хиломикроны являются наиболее крупными из липопротеидов и содержат до 98-99% липидов и только 1-2% белка. Они образуются в слизистой оболочки кишечника и обес-печивают транспорт липидов из кишечника в лимфу, а затем в кровь.

В ЛПНП количество белка составляет 9-20% , а среди липидов преобладают холе-стерин и триацилглицерины (до 40%). Белковая часть ЛПВП колеблется в пределах 35-50%, а белковая представлена фосфолипидами и холестерином. Таким образом, холестерин транспортируется по крови в составе липопротеидов, особенно ЛПНП.

Глава 7. Методы исследования белков

Среди методов, используемых в биохимии, ключевое значение имеют выделение веществ из биологических источников и, как правило, их очистка с целью получения индивиду-альных соединений.

Следует отметить три главные проблемы выделения в индивидуальном виде компонентов из живых организмов:

1) Исходный материал  биомасса состоит из многих сотен и даже тысяч различных соединений. Разделение таких смесей чрезвычайно сложно, кроме того многие ком-поненты этих смесей построены довольно однотипно (например, иммуноглобулины). В связи с этим они мало различаются между собой по физико-химическим характе-ристикам  растворимости или способности к сорбции на определенном типе сор-бента.

2) Работа с биохимическими объектами зачастую сопровождается необходимостью манипулировать с очень небольшими количествами исходного вещества. При ни-чтожно малом количестве используемого материала методы их детекции должны быть высокочувствительными. Такими методами являются спектрофотометрические методы, основанные на измерении поглощения видимого или ультрафиолетового света, радиохимические методы, основанные на изменении радиоактивности, и лю-минесцентные, основанные на изменении флуоресценции, био- и хемилюминесцен-ции.

3) Многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Часто задача состоит в том, чтобы выделить белок в нативном, т.е. сохраняющим биологическую активность состоянии. Между тем многие белки при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены денатурации, которая обычно сопровождается потерей биологической активности  инактивацией. Кроме того, в клетках часто имеются ферменты (в неповрежденных клетках в лизосомах) способные разрушить те или иные вещества, в первую очередь белки.

7.1. Традиционные методы выделения и очистки белков

Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в ре-зультате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга.

Выделение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей. На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая необходимым веществом, чем предыдущая. Такой процесс часто называют фракционированием.

На каждой стадии разделения белок находится либо в виде раствора, либо в виде осадка.

1) Осаждение. Для осаждения необходимо понизить каким-либо способом раство-римость белка. Как уже говорилось в гл.5, стр.22 растворимость белка зависит от их способности к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается расположением гидрофильных групп на по-верхности. Добавление органических растворителей понижает степень гидрата-ции и приводит к осаждению белка. В качестве таких растворителей используют ацетон. Осаждают белки также с помощью солей, например, сульфата аммония. Принцип этого метода основан на том, что при повышении концентрации соли в растворе происходит сжатие ионных атмосфер, образуемых противоионами белка, что способствует сближению их до критического расстояния, на котором меж-молекулярные силы ван-дер-ваальсова притяжения перевешивают кулоновские силы отталкивания противоионов. Это приводит к слипанию белковых частиц и их выпадению в осадок.

2) Изоэлектрическое осаждение. Заряд белков обусловлен в первую очередь ос-татками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина и ар-гинина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изо-электрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок.

3) Центрифугирование. Выпавший осадок белка можно выделить фильтрованием. Для этого часто пользуются центрифугами. Частицы осажденного вещества под действием центробежной силы оседают на дне центрифужных стаканов и сжи-маются в плотный осадок, с которого оставшийся раствор (надосадочная жидкость, или супернатант) легко сливается или отсасывается. Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги) создают центробежное ускорение порядка 105g (т.е. 105 ус-корений свободного падения), что позволяет осаждать даже некоторые крупные надмолекулярные агрегаты - рибосомы и вирусы.

4) Сорбция. Основана на различном сродстве компонентов смесей к определенным веществам  сорбентам. Наиболее часто используемый сорбент  гель фосфата кальция (гидроксиапатит) или активированный уголь. Эффективную сорбцию можно получить на ионитах  сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы. В исходном состоянии эти заряды скомпенсированы какими-либо под-вижными противоионами. Практически при сорбции на ионитах происходит об-мен этих противоионов. Если на поверхности сорбента находятся отрицательно заряженные группы, то он связывает катионы и его называют катионитом, соот-ветственно сорбент с положительно заряженными группами называют анионитом. В качестве ионитов чаще всего используют материалы (после соответствующей химической обработки) на гидрофильной основе  целлюлозе, декстране, сили-кагеле или пористых стеклах.

5) Ситовой эффект. Молекулярные сита представляют собой материалы с очень маленькими порами определенного размера. Следует отметить отличие этих “сит”: крупные частицы не остаются на поверхности материала сита, а обтекают его частички (гранулы), тогда как мелкие вещества примесей диффундируют в час-тицы сита и таким образом задерживаются. Материалом для молекулярных сит может служить сефадекс (полисахарид декстран, у которого после соответст-вующей обработки цепи оказываются сшитыми трехуглеродными мостиками) или полиакриламид, линейные цепи которого сшиты метиленовыми мостиками.

В перечисленных методах в конечной смеси остаются вспомогательные низкомоле-кулярные вещества  органические растворители, соли и кислоты. Для очищения от них используется метод диализа, упоминавшийся в главе “Свойства белков”. Диализ основан на применении мембран проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ и непро-ницаемых для белков. Чаще всего с этой целью используют пленки из целлофана (нитрат целлюлозы). В лаборатории подлежащий диализу раствор белка помещают в мешок из целлофана и погружаю последний в сосуд с водой. Непрерывный ток воды через сосуд приводит к полному переходу в него всех проходящих через целлофан веществ, а белки остаются внутри (см. иллюстрацию к гл.5).

7.2. Методы зонального разделения

Эти методы основаны на том, что создается некоторая система, в которой компоненты смеси перемещаются с различными скоростями. Если в такую систему ввести разделяемую смесь в виде некоторой зоны, то по мере ее перемещения компоненты смеси, движущиеся с разными скоростями, будут формировать отдельные зоны, которые затем можно разнести в разные приемники.

1) Хроматография. При разделении белков и их анализе используется жидкостная хроматография. В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ с по-мощью тока элюирующей (вымывающей) жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компо-нентам. При перемещении зоны с помощью тока элюента