Белки: история исследования, химсостав, свойства, биологические функции

элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона с разделяемой смесью.

В зависимости от природы физико-химического явления, лежащего в основе раз-деления веществ, различают адсорбционную, ионообменную, распределительную и гель-хроматографию (эксклюзивную хроматографию). В адсорбционной чаще всего используют оксид алюминия в качестве неподвижной фазы. В ионообменной используются те же типы ионитов, что в ионообменной сорбции. Распредели-тельная хроматогрфия основана на разделении веществ между двумя несмеши-вающимися жидкими фазами. Неподвижная жидкая фаза образуется в результате ее закрепления на пористом нерастворимом носителе. В гель

2) Электрофорез. В этом случае зоны создаются в результате того, что разные компоненты смеси с различной скоростью перемещаются в электрическом поле. После специальной обработки разделяемые смеси наносят на гель (декстроновый, полиакриламидный, или другой) а затем подключают но определенное время по-стоянный электрический ток. Белки в зависимости от своей молекулярной массы и заряда начинают двигаться с различной скоростью. После отключения тока гель помещают в специальный раствор, где интересующие исследователя белки ок-рашиваются. Существует электрофорез в растворе, но он имеет ограниченное применение, т.к. исследуемые белки часто подвергаются значительному диффу-зионному размыванию. Однако сейчас стало возможным применять этот метод в условиях невесомости в космосе, что устраняет конвекционные токи, обуславли-вающие диффузионную размывку.

Все описанные выше методы зонального разделения являются одномерными, разде-ление в них происходит в одной координате. Наряду с этим применяются двумерные сис-темы разделения на пластинах. При этом разделяемую смесь в виде пятна наносят на один из углов и разделяют в одном направлении. Затем какие-либо параметры, определяющие разделяющую способность системы изменяют и проводят разделение в перпендикулярном направлении. При удачном подборе системы и условий разделения удается разделить те компоненты, которые не разделились при первой процедуре. Комбинации методов могут быть довольно разнообразны: двумерная хроматография с использованием в разных на-правлениях разных элюентов, хроматография в одном и электрофорез в другом направ-лениях.

7.3. Определение первичной структуры белков

Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка располо-жения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода се-квенирования (от англ. sequence  последовательность).

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить ами-нокислотную последовательность а полипептидах, размер которых не превышает не-сколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

Таким образом определение первичной последовательности белка сводится к сле-дующим основным этапам:

1) Расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвениро-вания.

2) Секвенирование каждого из полученных фрагментов.

3) Сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков аромати-ческих аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специ-фичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитрако-новым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В та-ком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина.

Наряду с ферментативными методами используются и химические методы расщеп-ления белков. Для этой цели часто применяют бромциан, расщепляющий белок по остат-кам метионина:

Секвенирование проводят методом, известным как метод Эдмана. Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую -аминогруппу, каким-либо ал-кил- или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде приводит к образованию соответ-ствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой среде приводит (при значениях ки-слотности, не повреждающих пептидной связи) отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина. Оригинальная процедура Эдмана основана на использовании фенилизо-тиоцианата и тем самым на образовании фенилтиогидантоинов:

В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал амино-кислоты R1, который может быть идентифицирован путем измерения какой-либо физиче-ской или физико-химической характеристики, позволяющей различать гидантоины, соот-ветствующие разным входящим в состав белков аминокислотам. В качестве такой харак-теристики может служить хроматографическая подвижность в какой-либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра.

Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу вто-рого аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Мно-гократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередующихся процедур: добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отде-ления его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение остав-шегося полипептида в виде пригодном для следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблю-дения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения вех перечисленных операций  автоматические секвенаторы полипептидов. С их помощью удается произвести до 40  60 шагов ступенчатой деграда-ции.

Завершающим этапом установления первичной структуры белка является восстанов-ление порядка, в котором просеквенированные фрагменты располагались в исходном по-липептиде. Чаще всего для этой цели исползуют подход изветный как метод перекры-вающихся белков. Ниже излагается основная идея метода.

Если установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением иссле-дуемого белка с помощью трипсина (далее такие полипептиды обозначаются буквой Т  от слова “трипсиновые”), то остается определить для каждого из этих пептидов, с какими двумя Т-пептидами он соседствует с N- и С-конца. В структуре просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью отсутствует. Однако ее можно частично, а в ряде случаев и полностью восстановить, если располагать аналогичными данными для серии полипептидов, полученных расщеплением того же исследуемого белка по какой-либо другой группе аминокислотных остатков. Для определенности ниже речь будет идти о полипептидах, полученных расщеплением химотрипсином (пептиды группы С, chy-motryptic).

Как видно из рисунка, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи, то существует С-пептид, который либо содержит в своем составе полностью оба или один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С-концевую часть левого и N-концевую часть правого пептида группы Т. этот С-пептид перекрывает два соседних Т-пептида, с чем и связано название метода.

Таким образом, просматривая структуры пептидов Т и С, можно для любой пары Т-пептидов выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или разделены одним или несколькими другими Т-пептидами. Неоднозначность может появиться только в том случае, если перекрываемый каким-либо из С-петидов концевой фрагмент встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность этого как правило невелика. Если это все же происходит, то применяют более сложные методы комбинаторики.

Глава 8. Химический синтез полипептидов и белков

Химический синтез полипептидов и белков имеет большое практическое и теорети-ческое значение. В практическом отношении важны белковые гормоны - инсулин и вазо-прессин, в настоящее время получаемые синтетическим путем. Интересны и имеют прак-тическое применение пептиды группы пептидов мозга: метионин-энкефалин (TyrGlyGlyPheMet) и лейцин-энкефалин (TyrGlyGlyPheLeu). Эти соединения оказывают на мозговые центры такое же действие, как и морфин. Таким образом они могут применяться в качестве анальгетика, однако они практически не вызывают привыкания.

Традиционные методы синтеза регулярных полимеров