Биологическое окисление

кислоты свидетельствует и тот факт, что у человека почти не известны генетические изменения фер-ментов, катализирующих реакции цикла, так как наличие таких нарушений несовместимо с нормальным развитием.[10,1993]

Открытие ЦТК.

Впервые предположение о существовании такого цикла для окисления пирувата в животных тканях было высказано в 1937 году Гансом Кребсом. Эта идея родилась у него, когда он исследовал влияние анионов различных органических кислот на скорость поглощения кислорода суспензиями из-мельченных грудных мышц голубя, в которых происходило окисление пиру-вата. Грудные мышцы отличаются чрезвычайно высокой интенсивно-стью дыхания, что делает их особенно удобным объектом для изучения окислительной активности. Кребс также подтвердил, что обнаруженные ра-нее в животных тканях другие органические кислоты (янтарная, яблочная, фумаровая и щавелевоуксусная) стимулируют окисление пирувата. Кроме того, он нашел, что окисление пирувата мышечной тканью стимулируется шестиуглеродными трикарбоновыми кислотами - лимонной, цис-аконитовой и изолимонной, а также пятиуглеродной -кетоглутаровой кислотой. Испы-таны были и некоторые другие встречающиеся в природе органические ки-слоты, но ни одна из них не обнаружила подобной активности. Обращал на себя внимание сам характер стимулирующего действия активных кислот: даже малого количества любой из них было достаточно для того, чтобы вы-звать окисление во много раз большего количества пирувата.[9, 1991]

Простые эксперименты, а также логические рассуждения позволили Кребсу высказать предположение, что цикл, который он назвал циклом ли-монной кислоты, является главным путем окисления углеводов в мышце. После, цикл лимонной кислоты был обнаружен практически во всех тканях высших животных и растений и у многих аэробных микроорганизмов. За это важное открытие Кребс был удостоен в 1953 году Нобелевской премии. Юд-жин Кеннеди и Альберт Ленинджер показали позднее, что все реакции цикла лимонной кислоты протекают в митохондриях животных клеток. В изолиро-ванных митохондриях печени крысы были обнаружены не только все фер-менты и коферменты цикла лимонной кислоты; здесь же, как выяснилось, локализованы все ферменты и белки, которые требуются для последней ста-дии дыхания, т.е. для переноса электронов и окислительного фосфорилиро-вания. Поэтому митохондрии с полным правом называют «силовыми стан-циями» клетки.

Катаболическая роль цикла лимонной кислоты

Цикл начинается со взаимодействия молекулы ацетил-СоА с щавелево-уксусной кислотой (оксалоацетатом), в результате которого образуется шес-тиуглеродная трикарбоновая кислота, называемая лимонной. Далее следует серия реакций, в ходе которых происходит высвобождение двух молекул С02 и регенерация оксалоацетата. Поскольку количество оксалоацетата, необхо-димое для превращения большого числа ацетильных единиц в С02, весьма невелико, можно считать, что оксалоацетат выполняет каталитическую роль.

Цикл лимонной кислоты является механизмом, обеспечивающим улав-ливание большей части свободной энергии, освобождаемой в процессе окис-ления углеводов, липидов и белков. В процессе окисления ацетил-СоА бла-годаря активности ряда специфических дегидрогеназ происходит образова-ние восстановительных эквивалентов в форме водорода или электронов. Последние поступают в дыхательную цепь; при функционировании этой цепи происходит окислительное фосфорилирование, то есть синтезиру-ется АТФ.

Ферменты цикла лимонной кислоты локализованы в митохондриальном матриксе, где они находятся либо в свободном состоянии, либо на внутрен-ней поверхности внутренней митохондриальной мембраны; в последнем слу-чае облегчается перенос восстановительных эквивалентов на ферменты ды-хательной цепи, локализованные во внутренней митохондриальной мем-бране.[11, 1989]

Реакции ЦТК.

Начальная реакция - конденсация ацетил-СоА и оксалоацетата, катали-зируется конденсирующим ферментом, цитратсинтетазой, при этом происхо-дит образование связи углерод-углерод между метальным углеродом ацетил-СоА и карбонильным углеродом оксалоацетата. За реакцией конденсации, приводящей к образованию цитрил-СоА, следует гидролиз тиоэфирной свя-зи, сопровождающийся потерей большого количества свободной энергии в форме теплоты; это определяет протекание реакции слева на право до ее за-вершения:

Ацетил-СоА + Оксалоацетат + Н2О → Цитрат + CoA-SH

Превращение цитрата в изоцитрат катализируется аконитазой, содержа-щей железо в двухвалентном состоянии. Эта реакция осуществляется в две стадии: сначала происходит дегидратация с образованием цис-аконитата (часть его остается в комплексе с ферментом), а затем - гидратация и образо-вание изоцитрата:

Цитрат ↔ цис -Аконитат ↔ Изоцитрат – Н2О

Реакция ингибируется фторацетатом, который сначала превращается во фторацетил-СоА; последний конденсируется с оксалоацетатом, образуя фторцитрат. Непосредственным ингибитором аконитазы является фтор-цитрат, при ингибировании накапливается цитрат.

Эксперименты с использованием промежуточных соединений пока-зывают, что аконитаза взаимодействует с цитратом ассиметрично: она всегда действует на ту часть молекулы цитрата, которая образовалась из оксалоаце-тата. Возможно, что цис-аконитат не является обязательным интермедиатом между цитратом и изоцитратом и образуется на боковой ветви основного пу-ти.

Далее изоцитратдегидрогеназа катализирует дегидрогенирование с обра-зованием оксалосукцината. Описаны три различных формы изоцитратде-гидрогеназы. Одна из них, НАД-зависимая, найдена только в митохондриях. Две другие формы являются НАДФ-зависимыми, причем одна из них также находится в митохондриях, а другая в цитозоле. Окисление изоцитрата, свя-занное с работой дыхательной цепи, осуществляется почти исключительно НАД-зависимым ферментом:

Изоцитрат + НАД+ ↔ Оксалосукцинат (в комплексе с ферментом) ↔ альфакетоглутарат + СО2+ НАДН2

Рисунок 5. Реакции цикла Кребса.[10,1993]

Далее следует декарбоксилирование с образованием альфаке-тоглутарата, которое также катализируется изоцитратдегидроге-назой. Важным компонентом реакции декарбоксилирования являют-ся ионы Mg2+ (или Мn2+). Судя по имеющимся данным, оксалосукцинат, об-разующийся на промежуточной стадии реакции, остается в комплексе с фер-ментом.

Альфакетоглутарат, в свою очередь, подвергается окислительному де-карбоксилированию, сходному с окислительным декарбоксилированием пи-рувата: в обоих случаях субстратом является альфакетокислота. Реакция ка-тализируется альфакетоглутаратдегидрогеназным комплексом и требует уча-стия того же набора кофакторов - тиаминдифосфата, липоата, НАД+, ФАД и СоА; в результате образуется сукцинил-СоА - тиоэфир, содержащий высоко-энергетическую связь.

α-кетоглуторат + НАД+ + CoA-SH → Сукцинил-СоА + СО2 + НАДН+Н+

Равновесие реакции настолько сильно сдвинуто в сторону образования сукцинил-СоА, что ее можно считать физиологически однонаправленной. Как и при окислении пирувата, реакция ингибируется арсенатом, что приво-дит к накоплению субстрата (альфакетоглутарат).

Продолжением цикла является превращение сукцинил-СоА в сукцинат, катализируемое сукцинаттиокиназой (сукцинил-СоА-синтетазой):

Сукцинил-СоА + ФН + ГДФ↔ Сукцинат + ГТФ + CoA-SH

Одним из субстратов реакций является ГДФ (или ИДФ), из которого в присутствии неорганического фосфата образуется ГТФ (ИТФ). Это - единст-венная стадия цикла лимонной кислоты, в ходе которой генерируется высо-коэнергетическая фосфатная связь на субстратном уровне; при окислитель-ном декарбоксилировании α-кетоглутарата потенциальное количество сво-бодной энергии достаточно для образования НАДН и высокоэнергетической фосфатной связи. В реакции, катализируемой фосфокиназой, АТФ может об-разовываться как из ГТФ, так и из ИТФ. Например:

ГТФ+АДФ ГДФ+АТФ.

В альтернативной реакции, протекающей во внепеченочных тканях и ка-тализируемой сукцинил-СоА-ацетоацетат-СоА-трансферазой, сукцинил-СоА превращается в сукцинат сопряженно с превращением ацетоацетата в ацето-ацетил-СоА. Впечени имеется диацилазная активность, обеспечиваю-щая гидролиз части сукцинил-СоА с образованием сукцината и СоА.

Далее сукцинат дегидрогенируется, затем присоединяется молекула во-ды, и следует еще одна стадия дегидрогенирования, приводящая к регенера-ции оксалоацетата:

Сукцинат + ФАД  Фумарат + ФАДН2

Первое дегидрогенирование катализируется сукцинатдегидрогеназой, связанной с внутренней поверхностью внутренней митохондриальной мем-браны. Это единственная дегидрогеназная реакция ЦТК, в ходе которой осу-ществляется прямой перенос с субстрата на флавопротеин без участия НАД+. Фермент содержит ФАД и железо-серный белок. В результате дегидрогени-рования образуется фумарат. Как показали эксперименты с использованием изотопов, фермент стереоспецифичен к транс-атомам водорода метиленовых групп сукцината. Добавление малоната или оксалоацетата ингибирует сук-цинатдегидрогеназу, что приводит к накоплению сукцината.

Фумараза (фумаратгидротаза) катализирует присоединение воды к фу-марату с образованием малата:

Фумарат +Н2О  L-малат

Фумараза специфична к L-изомеру малата, она катализирует присоеди-нение компонентов молекулы воды по двойной связи фумарата в транс-конфигурации. Малатдегидрогеназа катализирует превращение малата