Определение активности ферментов

Российский химико-технологический Университет

им. Д.И.Менделеева

Кафедра промышленной биотехнологии

МЕТОДИЧЕСКАЯ РАБОТА

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Выполнила: студентка

группы Э-35

Тимошкина Е.А.

Преподаватель:

Мартимьянова Н.А.

Москва, 1996 г

СОДЕРЖАНИЕ

Свойства ферментов как биологических катализаторов. 1

Получение ферментных препаратов. 4

Общие методы определения активности ферментов. 6

Методы определения активности протеолитических ферментов 11

Литература 19

Свойства ферментов как биологических катали-заторов.

Фермент - от лат. fermentum - закваска; знзим - от греч. эн - внутри, зиме - закваска.

Ферменты, или энзимы, - это катализаторы белко-вой природы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Происхождение терминов связано с тем, что первоначально ферментативные процессы были открыты и изучены в бродильном производстве. В каж-дой клетке имеются сотни различных ферментов. С их помощью осуществляются многие химические реакции, которые могут с большой скоростью идти при темпера-турах, подходящих для данного организма, т.е. в пре-делах от 5 до 400 С. Чтобы эти реакции с той же ско-ростью протекали вне организма, потребовались бы вы-сокие температуры и резкие изменения некоторых других условий. Для клетки это означало бы гибель, так как вся работа клетки строится таким образом, чтобы избежать любых сколько-нибудь заметных измене-ний в нормальных условиях ее существования. Следова-тельно, ферменты можно определить как биологические катализаторы, т.е. как вещества, ускоряющие реакции. Они абсолютно необходимы, потому что без них реакции в клетках протекали бы слишком медленно и не могли поддерживать жизнь. Совокупность биохимических реак-ций, катализируемых ферментами, составляет сущность обмена веществ, являющегося отличительной чертой всех живых организмов. Через ферментативный аппарат, регуляцию его активности происходит и регуляция ско-рости метаболических реакций, их направленности.

Являясь катализаторами, ферменты имеют ряд общих с небиологическими катализаторами свойств:

1. Ферменты не входят в состав конечных продуктов реакции и выходят из нее, как правило, в первона-чальном виде, т.е. они не расходуются в процессе ка-тализа (в настоящее время доказано, что некоторые ферменты в конце химической реакции подвергаются мо-дификации и даже распаду, а не освобождаются в неиз-менном виде, как постулировал Л.Михаэлис).

2. Ферменты не могут возбудить те реакции, протека-ние которых противоречит законам термодинамики, они ускоряют только те реакции, которые могут протекать и без них.

3. Ферменты не смещают положения равновесия, а лишь ускоряют его достижение.

Специфические свойства:

1. Конечно же, по своему химическому строению все ферменты являются белками.

2. Эффективность ферментов намного выше, чем небио-логических катализаторов (скорость протекания реак-ции при участии фермента выше на несколько поряд-ков).

3. Ферменты обладают узкой специфичностью, избира-тельностью действия на субстраты, т.е. на вещества, превращение которых они катализируют. Высокая специ-фичность ферментов обусловлена конформационной и электростатической комплементарностью между молеку-лами субстрата и фермента и уникальной структурой активного центра фермента, обеспечивающими “узнава-ние”, высокое сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других химических реакций, осуществляющихся одновременно в живых клет-ках.

В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной (или групповой) специфично-стью и абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее зна-чение имеет тип химической связи в молекуле субстра-та. Например, пепсин расщепляет белки животного и растительного происхождения, хотя они могут сущест-венно отличаться друг от друга как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет углеводы или жиры. Объясняется это тем, что местом действия пепсина является пептидная -СО-NH- связь. Для действия липазы, катализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, таким местом является сложноэфирная связь. Аналогичной относительной спе-цифичностью обладают также некоторые внутриклеточные ферменты, например гексокиназа, катализирующая в присутствии АТФ фосфорилирование почти всех гексоз, хотя одновременно в клетках имеются специфические для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фосфорилирование.

Абсолютной специфичностью действия называют спо-собность фермента катализировать превращение только единственного субстрата. Любые модификации в струк-туре субстрата делают его недоступными для действия фермента.

Стереохимическая специфичность ферментов обу-словлена существованием оптически изомерных L- и D-форм или геометрических (цис- и транс- ) изомеров химических веществ. “Так, известны оксидазы L- и D-аминокислот, хотя в природных белках обнаружены только L-аминокислоты. Каждый из видов оксидаз дей-ствует только на свой специфический стереоизомер.

+ЅО2

L-аминокислота кетокислота + NH + H2O

оксидаза L-аминокислот

+ЅО2

D-аминокислота кетокислота + NH + H2O

оксидаза D-аминокислот

Наглядным примером стереохимической специфичности является бактериальная аспартатдекарбоксилаза, ката-лизирующая отщепление СО2 только от L-аспаргиновой кислоты с превращение ее в L-аланин” [1].

4. Регулируемость ферментов как биокатализаторов. “Через регуляцию ферментативного аппарата осуществ-ляется скоординированность всех метаболических про-цессов во времени и пространстве, направленное на воспроизведение живой метерии, поддержание постоян-ства внутриклеточной среды, на приспособление к ме-няющимся внешним условиям” [2].

5. Термолабильность ферментов. Скорость химических реакций зависит от температуры, поэтому катализируе-мые ферментами реакции также чувствительны к измене-ниям температуры. Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении темпера-туры будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Таким образом, термолабильность, или чувствительность к повышению температуры является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неоргани-ческих катализаторов. При 1000С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляют, очевидно, только один фермент мышечной ткани - мио-киназа, которая выдерживает нагревание до 1000С). При низких температурах (00С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля. Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. В настоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказано существование прямой зависимости между ско-ростью инактивации фермента и степенью денатурации белка. На термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.

6. Зависимость активности ферментов от рН среды. Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основном выработанным в про-цессе эволюции физиологическим значением рН среды 6.0 - 8.0. рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. Исключение со-ставляет пепсин, рН-оптимум которого равен 2.0. Объ-ясняется это тем, что пепсин входит в состав желу-дочного сока, содержащего свободную соляную кислоту, которая создает оптимальную кислую среду для дейст-вия этого фермента. С другой стороны, рН-оптимум ар-гиназы лежит в сильно щелочной зоне (около 10.0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа функционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне рН среды. Влияние изменений рН сре-ды на молекулы фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина и др.). При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или в не-ионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно формировании актив-ного фермент-субстратного комплекса. Кроме того, имеет значение и состояние ионизации субстратов и кофакторов.

Получение ферментных препаратов.

Для получения ферментных препаратов используют как микроскопические грибы, так и бактерии и дрожжи. Иногда получение технического ферментного препарата кончается проведением процесса ферментации, напри-мер, в спиртовой промышленности для осахаривания крахмала используют жидкую культуру Aspergillus niger. Впоследствии ее добавляют в жидком виде в ко-личестве 10-12% к осахареваемому затору. Однако ак-тивность ферментов в культуральной жидкости быстро снижается. Поэтому широко практикуют получение