Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii

СОДЕРЖАНИЕ

Введение. 3

Глава 1. Обзор литературы. 5

1.1 Протеиназы микробного происхождения. 5

1.2 Ферменты, их физико-химические свойства. 9

1.3 Выделение и очистка препаратов протеиназы. 13

1.4 Расщепление коллагенсодержащего сырья и его применение. 17

Глава 2. Материалы и методы исследования. 27

2.1 Определение рН. 27

2.2 Определение протеолитической активности. 27

2.3 Определение коллагеназной активности. 27

2.4 Определение молекулярной массы. 28

2.5 Определение содержания аминного азота. 28

2.6 Электрофоретические исследования. 29

2.6.1 Определение гомогенности очищенных препаратов 29

2.6.2 Идентификация протеиназ в ПААГ. 30

Глава 3. Получение препаратов протеиназы Penicillium wortmannii 2091

и исследование их физико-химических свойств. 31

3.1 Разработка условий выделения препарата

Penicillium wortmannii BKMF 2091. 31

3.2 Фракционирование протеолитического комплексного

препарата ферментов. 36

3.3 Влияние температуры и рН на активность фермента. 37

3.4 Определение молекулярной массы. 40

3.5 Исследование процессов кислотной и термической инактивации. 40

3.6 Влияние ионов металлов и ингибиторов на активный центр фермента. 44

3.7 Субстратная специфичность. 46

3.8 Гидролиз коллагенсодержащего сырья: ноги птиц, шквара. 47

Глава 4. Методическая часть. 57

4.1 Межпредметность – современный принцип обучения. 57

4.2 Межпредметные связи на уроках химии. 61

4.3 Методические рекомендации по реализации принципов

межпредметных связей при изучении тем, связанных

с понятием «ферментные препараты». 63

Выводы. 70

Список литературы. 71

ВВЕДЕНИЕ.

Важнейшим свойством ряда белков является их каталитическая активность. Вещества белковой природы, способные каталитически ускорять химические реакции, называют ферментами. Роль ферментов в жизнедеятельности животных, растений и микроорганизмов колоссальна. В настоящее время в биологических объектах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, а несколько сотен из них выделено и изучено.

Биологические катализаторы по ряду признаков резко отличаются от неорганических катализаторов. Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.

Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоком значении к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрат. Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. Специфичность – одно из наиболее выдающихся свойств ферментов. Данное свойство ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. Ферменты могут обладать абсолютной, относительной, стереохимической специфичностью. Влияние на ферменты активаторов и ингибиторов впервые было изучено А.Я.Данилевским. Ингибиторы тормозят действие ферментов. Механизм ингибирующего действия сводится к двум типам торможения (необратимое и обратимое). Обратимое ингибирование действия ферментов может быть конкурентным и неконкурентным.

Будучи выделены из организма, ферменты не утрачивают способности осуществлять каталитическую функцию, на чем основано их применение в различных областях промышленности. В хлебопекарной промышленности применяют ферментные препараты, относящиеся к роду Aspergillus. В пивоваренной и спиртовой промышленности применяют амилазы – ферменты, ускоряющие реакцию осахаривания крахмала. В кожевенном и меховом производстве применяют препараты протеиназ. Ферменты находят большое применение в медицине. Пепсин, трипсин, химотрипсин, липазу и амилазу применяют для лечения заболеваний ЖКТ. Протеолитические ферменты – плазмин и активирующие его стрептокиназу и урокиназу – для растворения тромбов в кровеносных сосудах. Кроме того, специфическую область применения ферментов в медицине составляет энзимодиагностика (заболевание может быть тестировано по уровню содержания фермента или соотношения его множественных форм в крови или реже в моче).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Протеиназы микробного происхождения.

Протеолитические ферменты синтезируются практически всеми живыми существами. В промышленных целях как источник протеиназ используются животные ткани, растения и клетки микроорганизмов. Наиболее перспективным источником протеиназ следует признать микроорганизмы по ряду существенных преимуществ, связанных, прежде всего, с неограниченностью источников, возможностью широко варьировать свойства методами селекции и генной инженерии, подбором условий биосинтеза, широким спектром ферментных комплексов и глубиной воздействия на различные субстраты, а так же простотой и относительной дешевизной технологии.

Продуценты протеолитических ферментов обнаружены среди самых различных групп микроорганизмов: бактерий (Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas), микромицетов (Aspergillus, Rhizopus, Penicillium), актиномицетов (Streptomyces, Actinomyces). На их основе у нас в стране и за рубежом создано крупнотоннажное производство ферментных препаратов протеолитического действия.

Многие широко распространённые микроорганизмы секретируют значительное количество протеолитических биокатализаторов в окружающую среду, что значительно облегчает задачу их выделения и очистки. Возможность управления образованием ферментов за счёт подбора соответствующей питательной среды и условий культивирования позволяет не только увеличить выход протеолитических ферментов, но и получать ферментные препараты с определёнными свойствами. Методы селекции и генной инженерии значительно увеличивают возможности целенаправленного биосинтеза ферментов. Существенна способность микроорганизмов вырабатывать ферменты, уникальные по своей субстратной специфичности (кератиназы, коллагеназы, эластазы).

Большое внимание, уделяемое изучению протеолитических ферментов микроорганизмов, привело к получению значительного числа препаратов бактериальных и грибных протеиназ в высокоочищенном состоянии.

В настоящее время в номенклатуру и классификацию ферментов внесено большое количество протеолитических ферментов микробного происхождения, которые относятся к различным подклассам. По современной классификации протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз и образуют подкласс пептид-гидролаз, или протеаз. Протеазы обычно подразделяются на пептидазы и протеиназы. Однако чёткого разделения по этому признаку нет, так как установлено, что протеиназы (пепсин, трипсин, папаин и другие) гидролизуют пептидные связи не только в белках, но и различных полипептидах. За последние годы значительно изменились представления о протеолитических ферментах. Согласно классификации Бергмана, подкласс пептид-гидролаз делится на две группы: эндопептидазы и экзопептидазы, которые отличаются специфичностью действия на субстрат. Эндопептидазы гидролизуют пептидные связи, отщепляя последовательно концевые аминокислоты. Эндопептидазы могут действовать на центральные участки пептидной связи и расщеплять молекулу